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实时定量pcr仪所用的荧光物质有哪几类?
  实时定量pcr仪是在从PCR基础上发展起来的,功能强大的多的一种在DNA扩增的同时可以实时检测核酸产物的方法。它用荧光化学物质对PCR进程进行实时检测,得到每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过与同时被测量的参考DNA浓度的比较,定量计算出待测基因的浓度。
  从仪器的技术含量角度看,qPCR仪,即实时荧光定量PCR仪技术及制造难度比PCR仪高的多,仪器的价值同样也高得多。
  实时定量pcr仪所使用的荧光物质可分为两类:荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下:
  1. TaqMan荧光探针:PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析,又可分析基因突变(SNP),有望成为基因诊断和个体化用药分析的心仪技术平台。
  2. SYBR荧光染料:在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料,SYBR荧光染料非特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBR仅与双链DNA进行结合,因此可以通过熔解曲线,确定PCR反应是否特异。
  3. 分子信标:是一种在5和3末端自身形成一个8个碱基左右的发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针,两端的核酸序列互补配对,导致荧光基团与淬灭基团紧紧靠近,不会产生荧光。PCR产物生成后,退火过程中,分子信标中间部分与特定DNA序列配对,荧光基因与淬灭基因分离产生荧光  。实时定量pcr仪
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